IPA分析免疫性疾病類風濕關節炎和二型糖尿病轉錄組潛在的共同通路和分子機制

2016-11-18 17:05:49 來源:源資科技市場部

新聞摘要:類風濕性關節炎(RA)和2型糖尿病(T2D)都為長期、復雜的系統性疾病,能夠增加心血管疾病的發病率和死亡率。RA是一種以關節病變為主的慢性全身自身免疫性疾病,發病過程中常伴有免疫系統的激活、炎癥反應等參與。T2D是一種由胰島素依賴性組織對胰島素生物學效應減弱(胰島素抵抗)以及胰島β細胞缺陷而形成的以空腹和餐后高血糖為主要特征的代謝異常綜合征。傳統上說,T2D不被認為是一種自身免疫性疾病,但越來越多的報道揭示其與包括低級炎癥相關的免疫反應機制密切相關。研究表明,當患者患有RA時,其患T2DM的風險明顯增加。

特此感謝天津中醫藥大學藥理學呂明博士提供本文


背景
      類風濕性關節炎(RA)和2型糖尿病(T2D)都為長期、復雜的系統性疾病,能夠增加心血管疾病的發病率和死亡率。RA是一種以關節病變為主的慢性全身自身免疫性疾病,發病過程中常伴有免疫系統的激活、炎癥反應等參與。T2D是一種由胰島素依賴性組織對胰島素生物學效應減弱(胰島素抵抗)以及胰島β細胞缺陷而形成的以空腹和餐后高血糖為主要特征的代謝異常綜合征。傳統上說,T2D不被認為是一種自身免疫性疾病,但越來越多的報道揭示其與包括低級炎癥相關的免疫反應機制密切相關。研究表明,當患者患有RA時,其患T2DM的風險明顯增加。免疫反應相關的機制是否為此兩種疾病發病的共同原因仍需進一步的討論和論證。綜上,我們提出假說:免疫反應為RA和T2D的共同發病機制。

  隨著二代測序技術的發展,mRNAs水平的高通量測序技術得到了廣泛的應用。IPA在組學分析中的作用尤為方便。結合IPA 獨特的“Comparison Analysis”模塊可將兩組或多組組學數據對比分析的功能,能夠很好的闡釋和分析疾病之間的共同生物過程(功能),基因通路,代謝通路,上游調控因子,關鍵基因等。IPA軟件“Core Analysis”下的“upstream regulators”預測功能,能夠幫助諸多研究者從組學數據中找到最為關注的上游調控分子做進一步的信號通路機制研究,并為新藥開發提供新的視角。


方法
1.收集臨床病例
      嚴格按照臨床相關標準分別搜集健康人和RA、T2D病人各10人(共30人),采集血液,梯度離心分離外周血單核細胞(PBMCs),-80℃保存備用,如表 1。

表 1 正常組和RA、T2D患者組病例采集信息

 


2.獲得差異表達基因
①從得到的PBMCs中利用試劑盒提取分離總RNA,將RNA樣品的吸光度A260/A280值控制在 1.8–2.2,RNA完整性系數(RIN值)>7.0。②分離mRNA,反轉錄合成雙鏈cDNA,建立Illumina文庫,Solexa方法進行測序。③分別將“RA患者”的基因和“T2D患者“的基因與正常組基因比較,設置篩選區間(Fold Change>1.5,p-value <0.01),得到的差異表達基因(DEGs),在后續介紹中分別用“RA”和“T2D”表示。


3.IPA分析
①將RA和T2D組的基因通過IPA的“Upload”選項導入。②通過“Core analysis”模塊分別對RA和T2D組的基因進行分析;與此同時,通過“Comparison”模塊對RA和T2D組的基因進行對比分析。③通過IPA的聚類功能,進一步分析RA和T2D組基因所調控的功能、通路、上游調控因子(Upstream Regulator)。


4.實驗驗證
通過IPA分析得到的22個關鍵候選基因,通過Q-PCR方法在搜集的臨床血液樣本PBMCs中進行驗證。


結果
1.根據得到的測序結果,與正常組相比,得到212個RA相關的差異基因和114個T2D相關的差異基因。RA差異基因中有157個基因上調,23個基因下調;T2D差異基因中有48個基因上調,34個基因下調;紅色代表上調基,綠色代表下調基因,如圖1。

 

圖 1 RA和T2D患者組與正常組基因差異數量


2.基于差異基因,通過IPA的對比分析功能對RA和T2D的差異基因進行深入分析。得到RA和T2D共同的P值分數(P值用于衡量相關度,P值越低,表示相關度越高)最低的10個Top 10信號通路:completement system, agranulocyte adhesion and diapedesis, granulocyte adhesion and diapedesis, IL-8 signaling, differential regulation of cytokine production in macrophages and T helper cells by IL-17A and IL-17F, Natural killer cell signaling, differential regulation of cytokine production in intestinal epithelial cells by IL-17A and IL-17F, acute phase response signaling, crosstalk between dendritic cells and natural killer cells, and OX40 signaling pathways,如圖 2A。細節展示,如圖 3。在Top 10信號通路中涉及調控的19個關鍵差異基因: CYP4F3↑, DEFA4↑, DEFA1↑, MMP8↑, MMP9↑, MT2A↓, ITGB4↓, RBP1↓, SNAI1↓, ARG1↑, MPO↑, LTF↑, C4BPA↑, MYL4↑, HLA-DQA2↑, CA1↑, SELENBP1↑, BPI↑, CD177↑, CA4↑, BMX↑,如表 2。得到RA和T2D共同的P值分數最低的10個Top 10生物功能: systemic autoimmune, syndrome, rheumatic disease, system lupus erythematosus, binding of cells, rheumatic arthritis, arthritis, chronic inflammatory disorder, binding of blood cells, cell death and apoptosis,如圖 2B。這些功能大部分與免疫功能紊亂相關。在Top 10生物功能中涉及調控19個關鍵差異基因:ARG1↑, BPI↑, CA1↑, CYP4F3↑, DEFA4↑, DEFA1↑, HLA-DQA2↑, LTF↑, MMP8↑, MMP9↑, MPO↑, SELENBP1↑, CD177↑, ITGB4↓, SNAI1↓, MT2A↑, BMX↑, CA4↑,這些基因多數可歸類于免疫反應,如表 2。由此可見,免疫反應可能為RA和T2D的共同潛在機制

 

圖 2 RA和T2D相關的Top 10信號通路和功能熱圖

表 2 RA和T2D相關的Top 10信號通路和功能相關調控基因(黑色斜體代表兩種疾病差異基因中共同基因)

 

 

圖 3 RA和T2D相關的Top 10具體信號通路


3.基于RA和T2D的差異基因,通過IPA對其的上游調控因子進行預測。根據IPA的P值,選出最為關心的5個上游調控分子:TGM2, NF-кB, p38 MAPK, TNF, CEBPA,這5個分子在RA和T2D中均為基因表達上調,如表3。5個上游調控分子所調控的下游基因及5個上游調控分子在RA和T2D中分別調控的下游基因,如圖 4。

表 3 上游調控因子所涉及的下游調控基因及基因相關功能

 


 

圖 4差異基因的上游調控因子及其在RA和T2D中的作用關系


4.整合Top 10信號通路和Top 10功能相關的關鍵基因共22個:DEFA1↑, RBP1↓, C4BPA↑, MYL4↑, HLA-DQA2↑, CA1↑, ARG1↑, BPI↑, CYP4F3↑, DEFA4↑, HLA-DQA2↑, LTF↑, MMP8↑, MMP9↑, MPO↑, SELENBP1↑, CD177↑, ITGB4↓, SNAI1↓, MT2A↑, BMX↑, CA4↑。通過Q-PCR對RA和T2D的PBMCs中關鍵差異基因進行驗證,其中12個基因與正常組相比,具有顯著性差異表達。其中基因表達顯著上調的8個基因為C4BPA, ARG1, MMP9, DEFA1, CYP4F3, LTF, MPO, DEFA4,MMP8,p-value < 0.01;基因表達顯著下調的3個基因為RBP1, SNAI1,MT2A,p-value < 0.01,如圖 5。 進一步對RA組和T2D組與正常組相比的差異基因與免疫相關的基因通路進行整合,如圖 6。

 

圖 5 RA和T2D與正常組對比的差異基因Q-PCR驗證

 

圖 6 RA和T2D與免疫相關的基因通路匯總


結論
1.免疫反應為RA和T2D的共同機制,分析得到的Top 10信號通路、Top 10功能、關鍵的5個上游調控因子及免疫相關的通路整合,為后續臨床治療RA和T2D提供新的治療策略,也為針對此兩種疾病的新藥研發提供較好的參考依據。

2.IPA的對比分析功能能夠高效的從分子機制角度闡述兩種或多種疾病之前存在的異同點,無論是針對闡釋西醫治療多種疾病及其并發癥,還是中醫對于疾病的整體觀理論,都能得到較好的應用。

3.實驗驗證出的結果和IPA分析出的差異基因結果趨勢基本一致。再一次證明IPA分析的可靠性和準確性。

4.以此案例為參考,研究者可深入進行其它兩種或多種疾病的對比研究,也可舉一反三到不同藥物對比作用機制研究中,為臨床、基礎、藥物研究等提供很好地思路和借鑒。


原文:Niu X, Lu C, Xiao C, et al. The Crosstalk of Pathways Involved in Immune Response Maybe the Shared Molecular Basis of Rheumatoid Arthritis and Type 2 Diabetes. PloS one, 2015;10(8):e0134990.

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