IPA應用——縱向轉錄組分析發現治療的急性萊姆病患者持續的差異基因表達特征

2017-02-15 17:20:54 來源:源資科技市場部

新聞摘要:萊姆病(Lyme disease)是蜱傳播萊姆病螺旋體細菌(Borrelia burgdorferi)引起的疾病,與關節炎、腦膜炎與面部神經麻痹相關,極少數患者因心肌炎猝死。大多數患者接受合適的抗生素治療后,能夠快速康復,無后遺癥。而少數病人仍具有持續性癥狀,伴隨傳播性疾病,發展為更嚴重的疾病,延遲抗生素治療。


背景
      萊姆病(Lyme disease)是蜱傳播萊姆病螺旋體細菌(Borrelia burgdorferi)引起的疾病,與關節炎、腦膜炎與面部神經麻痹相關,極少數患者因心肌炎猝死。大多數患者接受合適的抗生素治療后,能夠快速康復,無后遺癥。而少數病人仍具有持續性癥狀,伴隨傳播性疾病,發展為更嚴重的疾病,延遲抗生素治療。
      為了更好地理解人類宿主在急性萊姆病的反應機理和治療后癥狀發展中的作用,本文對29位剛確診的萊姆病患者和13位對照組的周邊血液單核細胞(PBMCs)進行轉錄組研究,治療后觀察6個月。使用IPA軟件對轉錄組數據進行網絡和通路分析,探索急性萊姆病和治療后癥狀的分子機制,發現可能性治療標志物。


病人招募,樣本收集和轉錄組分析
     
分別在3個時間點收集29位急性萊姆病患者和13位沒有急性疾病的對照組的PBMC樣本,進行RNA-Seq與通路分析。3個時間點分別是:V1(診斷急性萊姆病的時間,比開始抗生素治療的時間早),V2(四環霉素治療3周,即一個療程后),V5(治療完成后6個月)。

 

圖1 本文研究原理圖
(A)臨床預估時間線和PBMCs取樣;(B)疾病治愈或有持續癥狀的患者數量流程圖。注:PTLDS,萊姆病治療后癥狀。


轉錄組數據分析結果
1. 萊姆病基因表達特征
      研究初步比較V1的29位萊姆病患者與13位對照的PBMC轉錄組,發現了1235個差異性表達基因(DEGs)(見圖2A與表1),其中大約69%(n=847)DEGs上調,31%(n=388)DEGs下調。在V2的轉錄組數據分析發現了1060個DEGs,其中63%(n=670)DEGs上調,37%(n=390)DEGs下調。63% DEGs都出現在V1與V2(見圖2B)。與對照組相比,在V5的萊姆病轉錄組沒返回基線,仍有686個DEGs,其中54%(n=373)DEGs上調,46%(n=313)DEGs下調。主要成分分析(Principal Component Analysis,PCA)顯示每個樣本分類(V1、V2、V5與對照組)的部分重疊簇(見圖2C)。

表1 DEGs數量,|Fold Change|≥1.5,P值<0.05,FDR<0.1%

 


2. 萊姆病轉錄組的通路分析
      IPA分析萊姆病DEGs,預測通路結果顯示,在V1時,炎癥反應、監測免疫細胞與血液系統通路是激活狀態,這跟急性感染階段(如:萊姆病)的預期一致(見圖2D與圖3)。這些類型的通路在V2與V5時,仍是激活狀態,而在V5時,總體的基因表達模式是受到更強烈的抑制(圖3)。
      IPA分析轉錄組數據,預測10個最相關的經典通路結果顯示,V1的第8個通路、V2的第10個通路和V5的第4個通路與宿主免疫應答相關(見圖2E)。調控翻譯開始和延伸的eIF2信號通路在三個時間點都是顯著下調,而TREM1通過DAP12、白細胞介素6(IL-6)與IL-12的上調,介導的Th1促炎反應通路只在V1與V2顯著上調。另外,與炎癥和細胞凋亡相關的多個Toll樣受體(TLR1,-2,-4,-7與-8)在V1與V2也是顯著上調。
      在V1與V2,萊姆病的大多數上游調控子是促炎細胞因子、標志物(CSF2、γ干擾素[TNF-γ] 與抗促炎細胞因子(IL-6與IL-10))、細胞表面標志物CD40L、轉化生長因子β1、信號轉導介導因子TICAM、轉錄調控因子NF-κB和免疫球蛋白復合物(見圖2F)。TNF-α是eIF2信號傳導、TREM1和TLR通路的主調控子。在V5,10個最相關的上游調控子主要調控基因表達(MYCN、HOX-A7、SAT-B1、HNF-4A、MYC、FOS和ELAVL1)(見圖2F)。

 

 

圖2 IPA分析萊姆病DEGs結果
(A)萊姆病診斷時(V1)、治療后3周(V2,抗生素標準治療周期后)和治療后6個月(V5),三個時間點的上調基因數量或下調基因數量的柱狀圖。(B)萊姆病患者和對照組在三個時間點的DEGs數量的文氏圖。(C)萊姆病患者和對照組在三個時間點鑒定的1759個獨特的DEGs的主成分分析(PCA)圖。星號表示對照組的一個DEG看起來在PCA圖外,但事實卻相反。注意PC軸占數據集變異的8%。(D)10個最相關的疾病和功能。(E)10個最相關的經典通路。(F)10個最相關的上游調控子(不包括藥物)。圖D-F內容是IPA分析三個時間點的轉錄組測序數據,進行通路和基因的富集性分析的結果。根據預測的-log(P值)對通路、疾病等進行排序,分別取前10個結果。顏色根據Z值標注,橘色表示激活,藍色表示抑制,灰色表示活性狀態不確定,紅色線表示IPA分析設置的顯著性閾值(P<0.05)。

 

圖3 預測與萊姆病相關的疾病或功能熱圖

  IPA分析V1、V2與V5轉錄組數據,分別與數據集最相關的疾病或功能熱圖。熱圖顏色根據Z值而定,橘色表示激活,藍色表示抑制,灰色表示不確定活性狀態。


3. 比較急性萊姆病與其他感染疾病
      將急性萊姆病患者在V1的轉錄組數據與12個以前發表的其他急性病毒(細菌)感染患者或體外感染的細胞培養模型的轉錄組數據集,進行比較分析。根據分析結果(見圖4A與4B)可知,萊姆病螺旋體細菌體外感染人類其他細胞的轉錄組數據,其中44% DEGs與萊姆病在V1的相同。此外,萊姆病螺旋體細菌體外感染人類內皮細胞的轉錄組數據29% DEGs與萊姆病在V1的相同、人類神經母細胞瘤細胞的是13%和原代猴膠質細胞的是11%。

 

圖4 萊姆病轉錄組與其他臨床疾病或細胞模型的轉錄組比較
(A)急性萊姆病在V1與其他傳染疾病或感染的體外細胞培養模型的轉錄組數據比較,相同的DEGs與經典通路百分比柱狀圖。(B)比較急性萊姆病在V1的相關通路與其他細菌或病毒感染的相關通路,部分通路-log(P值)對比柱狀圖。(C)比較急性萊姆病在V5與三種慢性和(或)自身免疫綜合癥(SLE、CFS和RA)的轉錄組數據,相同的DEGs和經典通路百分比柱狀圖。(D)比較急性萊姆病在V5與三種慢性和(或)自身免疫綜合癥的相關通路,部分通路-log(P值)對比柱狀圖。顏色根據Z值而定,橘色表示激活,藍色表示抑制,灰色表示活性狀態不能預測。紅色線表示IPA分析設置的顯著性閾值(P<0.05)。


結論
1.萊姆病早期的基因表達特征與其他急性感染病不同,感染后至少持續三周。
2.研究發現多個之前未發現的通路和基因,例如: HLA基因(HLA-DQA1、 HLA-DQB1與HLA-DRB5)將來可能是萊姆病診斷的生物標志物,可能是研發新療法的潛在靶標。
3.IPA軟件分析轉錄組DEG數據的結果是本研究結果或討論的基礎。


原文
Longitudinal Transcriptome Analysis Reveals a Sustained Differential Gene Expression Signature in Patients Treated for Acute Lyme Disease. J Bouquet, MJ Soloski, A Swei, et al. American Society of Microbiology, January/February 2016 Volume 7 Issue 1 e00100-16.

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