IPA案例十——轉錄組數據分析

2017-05-19 10:52:55 來源:源資科技市場部

新聞摘要:禽類白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽類的治病病毒,導致禽類死亡和禽類健康下降,造成經濟損失慘重。

IPA分析轉錄組數據,揭示ALV-J病毒在SPF雞體內的治病性炎癥應答機制


背景
????? 禽類白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是禽類的治病病毒,導致禽類死亡和禽類健康下降,造成經濟損失慘重。
????? 864個基因/7個miRNAs/17 IncRNA在感染ALV與沒感染ALV的鳥類中差異表達。


實驗材料與方法
材料
????? 無病原體的白來航優質雞(white Leghorn egg-type chicken)長至40天時,實驗組注射雞白血病病毒J亞群(ALV-J) SCDY1,對照組注射PBS。注射后第40天的脾(實驗組與對照組各3例)進行轉錄組測序。分析測序數據,對mRNA、lncRNA與miRNA表達水平分別進分析,發現差異表達基因,即mRNA差異表達基因、miRNA靶標差異表達基因、lncRNA靶標差異表達基因和病毒共表達的差異表達基因。


軟件
????? IPA軟件分析四個數據集,mRNA差異表達基因數據集(mRNA數據集)、miRNA靶標差異表達基因數據集(miRNA數據集)、lncRNA靶標差異表達基因數據集(lncRNA數據集)和病毒共表達的差異表達基因數據集(病毒數據集)。


結果
1.IPA通路分析結果
????? 經典通路分析結果顯示,注射ALV組具有6個顯著性通路(|z-score| > 2),這些通路都與免疫相關,其中5個通路被激活,只有STAT3通路被抑制,見圖1a。IPA預測靶基因具有65個激活的上游調控子,幾乎所有重要的調控子與天然免疫相關,其中包括IFNs(7個基因)、IRFs(4個基因)和TLRs(2個基因)。此外,IPA下游分析預測與差異表達基因相關的16個功能,其中炎癥和免疫應答疾病是顯著相關功能,代謝與生殖系統疾病也具有顯著性,見圖1b。IPA還預測了一個新的分子作用網絡,具有三個核心分子,即NF-kB、IRF1和IRF7。這三個分子與病原體識別過程相關,見圖1c。

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圖1 IPA分析與病毒基因相關的差異表達基因 (a)重要的經典通路,橘色表示通路被激活,藍色表示通路被抑制,顏色越深,表示作用活性越顯著。(b)下游疾病和生物通路。(c)預測的分子作用網絡顯示大量與免疫相關的基因以中心分子NF-κ B、IRF1 和IRF7相關,這三個分子與病原體識別過程相關。點線表示非直接作用關系,實線表示直接作用關系。紅色的基因表示表達上調的基因,綠色表示表達下調的基因,灰色表示IPA預測的基因。

? IPA分析260個miRNA靶標差異表達基因的數據集,功能分析結果發現其中204個基因與癌癥功能相關。經典通路分析結果包括所有與病毒共表達的差異表達基因數據集相關的通路,其他激活的通路是death receptor signaling、 retinoic acidmediated apoptosis 與UVA-induced MAPK biosynthesis I,抑制的通路是cAMP mediated signaling。上游分析預測27個與免疫相關的基因處于激活狀態,包括IRF1、 IL5、 IFNG 和 STAT1。IPA功能分析預測lncRNA靶標差異表達基因的數據集,發現390個基因中有254個基因與癌癥疾病相關。該數據集經典通路分析結果包括來自病毒組的所有通路,包括被抑制的glioma signaling。


2.IPA對比分析結果
????? 另外,IPA比較分析四種類型數據的綜合數據集,分析不同數據之間的同性。四個數據集的幾個重要的顯著性通路是相同的,見下圖2a。前三個顯著性通路中有兩個通路 “Retinoic acid Mediated Apoptosis Signaling”與“Death Receptor Signaling”被激活,而“cAMP-mediated signaling”被抑制。mRNA數據集經典通路的Z值絕對值最小。有趣的是,幾乎所有預測的下游疾病與功能被抑制,包括“lymphoproliferative disorder”、 “migration of cells” 與“vasculogenesis”,見圖2b。四個數據集的上游調控因子分析結果具有較好的一致性,見圖2c。大多數激活狀態的上游調控子與天然免疫相關,例如,IFNA2、? IFNG、 IRF7、? CSF2、 IFN beta 、TLR9、IRF1、TLR3 和STAT1,高度富集到模式識別受體通路與免疫應答。

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圖2 IPA對比分析四個數據集的熱圖 從左到右:lncRNA數據集,miRNA數據集,病毒數據集和mRNA數據集。(a)重要的經典通路,(b)疾病和生物功能,(c)預測的上游調控子。


3.IPA分析mRNA、 miRNA和lncRNA數據集的共表達網絡
????? 研究特定調控的基因與相應調控因子相關,WGCNA用于決定特定基因表達與所有差異性表達的編碼蛋白的基因相關,miRNA、lncRNA數據集和病毒數據集。本文發現34個不同的共表達網絡,分別具有5-62個基因不等,見圖3a。其中4個網絡(第1個、第6個、第28個和第29個),這4個網絡中的基因與ALC-J刺激和免疫應答相關。
????? 第1個網絡包括10個miRNA、1個lncRNA和 27個編碼蛋白的基因,FSTL4基因作為中心分子,見圖3b。27個編碼蛋白的基因中的19個基因與疾病多態性和腫瘤相關。網絡的一部分包括3個miRNA——miR-223、miR-6670-5p和miR-190-3p,1個lncRNA——LOC_013679,與14個編碼蛋白相互作用,包括Lef1和TAP1。其他7個miRNA——miR-460B-5P、miR-383-5p、miR-181b-5p、gga-let-7b、miR-301b-3p、miR-10a-3p和miR-217-5p,其他13個相互作用的編碼蛋白的基因構成網絡的另一半,這些分子與免疫系統、關節積血、閉塞性動脈硬化和細胞凋亡等相關。
????? Novel_48作為一個新miRNA是第6個網絡的中心分子,連接兩部分編碼基因的蛋白,見圖3c。這個網絡中所有編碼蛋白的基因與疾病免疫應答相關,一部分包括HDP基因家族——AvBD1、AvBD4、AvBD6和AvBD7,另一部分12個基因中的10個基因與疾病功能相關,例如,RASGEF1B釋放了GDP,激活RAS信號傳導。
第28個網絡是發現的兩個最小網絡之一,ALV基因——env與2個miRNA(miR-7 與novel_51)、8個編碼蛋白的基因直接作用,見圖3d。
????? lncRNA LOC_009715是第29個網絡的中心調控子,與其他9個編碼蛋白的基因相互作用,見圖3e。

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圖3 四個數據集的共表達網絡分析結果 (a)網絡分析發現34個網絡,每個網絡至少具有7個基因。(b)網絡1包括10 個miRNA、1個lncRNA和27個編碼蛋白的基因。(c)網絡6具有一個新miRNA——novel_48,作為這個網絡的中心基因,連接2部分編碼蛋白的基因。(d)網絡28具有ALV基因-env,直接與2個miRNA——miR-7 和novel_51、8個編碼蛋白的基因相互作用。(e)網絡29具有一個lncRNA——LOC_009715作為這個網絡的中心調控子,調控9個編碼蛋白的基因。


結論
????? 1.IPA對來自實驗組的380個差異性表達的基因的分析結果顯示,宿主對病原體的反應機制包括病原體識別和抵御,細胞凋亡和免疫通路被激活。
????? 2.經典通路分析發現了p53 signaling、RIG-I 和STAT3通路。
????? 3.下游功能分析預測一系列免疫應答
????? 4.網絡分析發現了3個關鍵基因——NF-κ B、IRF1和IRF7,它們與7個表達上調的基因相互作用,這些基因與多種癌癥相關。

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