IPA案例十三——使用IPA挖掘衰老成骨細胞中的特異基因

2018-03-16 15:21:38 來源:源資科技市場部

新聞摘要:使用IPA的microRNA分析功能,深度挖掘正常和衰老的成骨細胞(osteoblasts)差異表達基因,獲得與衰老相關的肌肉骨骼疾病新的候選基因及新的神經源性異位骨化生物標記物。


背景:
      在衰老過程中,成骨細胞的功能缺失是成骨失衡和衰老引起的骨流失的關鍵因子。本文旨在對比正常和衰老的成骨細胞(osteoblasts)挖掘出差異表達基因,從而能夠尋找到在衰老過程中的骨質改變相關的基因。本文基于二代測序技術和生物信息學分析方法,鑒定出12個差異表達的microRNA和22個差異表達基因。其中在髖部骨質疏松性骨折的數據集GSE74209中,miR-204-5p被證實為上調表達。經查詢,miR-204-5p的潛在靶基因為KLF7(Kruppel-like factor 7)和SOX11(SRY-box 11)。通過使用IPA進行挖掘發現,SOX11參與了骨關節炎通路和成骨細胞分化過程,結合潛在的上游調節因子miR-204-5p,詮釋了miR-204-5p-SOX11在人類衰老過程中骨質變化的調節作用。此外,SEMA3A (semaphorin 3A) 和EPHA5 (ephrin type-A receptor 5)參與了神經系統相關的生物學功能,本文假設SEMA3A 和EPHA5之間有潛在聯系可能會參與神經源性異位骨化的生物學過程。綜上,本文發現了老年肌肉骨骼疾病診段的新的候選基因,并且提出神經源性異位骨化的新的生物標志物。


實驗及數據分析方法:
      采用P1和P8代的成骨細胞系(osteoblasts)分別進行mRNA和microRNA的測序。從中選擇顯著表達差異的microRNA并且尋找其潛在的靶標mRNA并使用IPA進行表達量的配對分析(“microRNA-mRNA campare dataset” tool)進行mRNA的篩選。并且對尋找到的基因列表進行功能網絡挖掘和通路挖掘,尋找潛在的biomarker。


分析結果:

 

圖一:(A)通過測序獲得的microRNA表達值采用閾值為|FC|>2, RPM>10獲得了10個上調的microRNAs和19個下調的microRNAs。使用miRmap進行microRNA的靶標mRNA預測打分(score>=99.0),獲得上調的microRNAs共有381個潛在靶標mRNA,而下調的microRNAs共有606個潛在靶標mRNA。使用IPA能夠mapped識別上調的microRNAs共有378個潛在靶標mRNA,而下調的microRNAs共有599個潛在靶標mRNA。之后,再使用IPA的microRNA-mRNA配對分析,根據mRNA的表達值(|FC|>2)找到了 ,當microRNAs上調時共有356個靶標mRNA下調,而下調的microRNAs共有399個潛在靶標mRNA上調表達。其中有22個microRNA-mRNA存在于本文的實驗NGS數據中(表一所示)。(B)差異表達的29個microRNA在P1和P8的osteoblasts樣本中的表達熱圖(z-Score)。


表一. 使用IPA的microRNA-mRNA配對分析挖掘出的22個microRNA-mRNA關系列表及基因表達值。

 


 

圖二: 將表一中5個上調的microRNA(A)和7個下調的microRNA(B)在髖部骨質疏松性骨折的數據集GSE74209的表達值,發現miR-204-5p(上調)和miR-335-3p(下調)在這一數據樣本中具有顯著的表達值。根據表一,得到了miR-204-5p的靶標基因KLF7 和SOX11,以及miR-335-3p的靶標基因KIAA1462和SVIP共四個基因。


表二. 將表一中找到的22個基因直接上傳到IPA進行NETWORK網絡分析,得到了三個網絡,經過打分,其中有兩個網絡得分較高。這三個網絡分別參與了cancer, organ injury and abnormality, tissue morphology, endocrine system disorders, cellular development, cell-mediated immune response and cellular movement等疾病或生物學功能。其中,經過圖二發現的四個基因中有三個都共存于網絡二中。

 


 

圖三:IPA的NETWORK網絡分析中的Network 2的分子網絡結構圖。

 

圖四:將miR-204-5p作為潛在的上游調節因子進行數據集的分析。使用IPA的overlay功能,能夠看到這些分子參與了canonical osteoarthritis pathway, Wnt/β-catenin pathway這兩個通路,并且圖中紫色標識的分子參與了differentiation of osteoblasts功能。圖中能看到SOX11 同時參與了這兩個通路和這一生物功能。


表三.將圖四中的miR-204-5p及其下游分子導入到IPA進行功能分析,發現ALPL, CYP1B1, EGR1, GREM1, IGFBP5, PRDM1和SOX11 參與了differentiation of osteoblast and muscle cells, bone mineralization and mineral density, 以及osteoclastogenesis等生物學功能。

 


 

圖五:將NGS數據的差異表達基因導入到IPA進行分析,挖掘出25個分子網絡。從中間挑出skeletal diseases and functions annotation功能, 包括bone mineral density, differentiation of osteoblasts, osteoarthritis and damage of cartilage tissue這三個功能網絡聯合做圖,尋找潛在的相關基因。其中可以看到SOX11 是networks of osteoblast differentiation和bone mineral density連接分子,并且預測其能夠抑制EGR1 且激活PRDM1這兩個參與bone mineral density網絡的分子。

 

圖六:將表二中的network1用IPA的overlay功能進行經典通路分析,可以看到EPHA5和 SEMA3A參與了axon guidance pathway。


總結:
      使用IPA進行microRNA-mRNA配對分析,能夠方便有效的鎖定microRNA和mRNA。并且能夠提供后續的分子功能以及通路分析。除此之外,IPA還能夠提供多角度的分析報告,適用于研究人員快速進行RNA-seq,small RNA-seq和蛋白組學的深入數據挖掘。


原文文獻:
Chen, Y. J., Chang, W. A., Huang, M. S., Chen, C. H., Wang, K. Y., & Hsu, Y. L., et al. (2017). Identification of novel genes in aging osteoblasts using next-generation sequencing and bioinformatics. Oncotarget, 8(69), 113598-113613.

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